En 1995, les jeunes Natasha Romanoff et Yelena Belova se trouvent dans l’Ohio, aux États-Unis, aux côtés de leurs parents adoptifs, Alexei Shostakov (anciennement connu comme Red Guardian, le Captain America Russe) et l’ancienne Veuve Noire Melina Vostokoff. Ils vivent paisiblement dans leur maison et n’attirent l’attention de personne. Un soir, Shostakov rentre dans l’urgence et la famille quitte le pays précipitamment, sous les balles du S.H.I.E.L.D., marquant la fin de leur mission après la destruction d’un institut. Arrivé à Cuba, Shostakov retrouve le Général Dreykov, tandis que Vostokoff est prise en charge médicalement pour une blessure par balles et que les deux jeunes filles sont ramenées à la Chambre Rouge pour continuer leur formation de tueuses.
Des années plus tard, en 2016, à la suite de la bataille ayant opposé les Avengers à l’aéroport de Leipzig/Halle, Romanoff est en cavale, poursuivie par le gouvernement pour violation des Accords de Sokovie. Elle parvient à échapper au Secrétaire d’état Thaddeus Ross et se rend dans un refuge en Norvège où elle retrouve son contact Rick Mason. Ailleurs, Belova travaille toujours pour la Chambre Rouge, où elle poursuit et tue Oksana, une ancienne Veuve. Pendant l’affrontement, elle entre en contact avec une substance appelée la poudre rouge qui supprime neurologiquement le contrôle mental de la Chambre Rouge sur elle. Belova prend la fuite jusqu’à Budapest et envoie l’antidote au refuge de Romanoff, dans l’espoir d’obtenir son aide.
Alors que Romanoff conduisait en transportant l’antidote sans le savoir, elle est violemment prise en embuscade par le Taskmaster, qui cherche uniquement à mettre la main sur la poudre. Après un duel intense, Romanoff semble être vaincue mais parvient à s’échapper avec la poudre. Elle comprend alors la provenance de l’objet. Elle se rend à Budapest où elle retrouve sa sœur à l’issue d’un duel. Belova lui fait comprendre que la Chambre Rouge est toujours active et que Dreykov est toujours en vie, mais elles sont attaquées par les Veuves Noires. Pendant leur fuite, Romanoff lui explique que pour rejoindre le S.H.I.E.L.D. à l’époque, sa mission consistait à tuer Dreykov. Après avoir fait exploser un bâtiment avec lui et sa jeune fille Antonia à l’intérieur – un acte qui la hante depuis, les deux furent présumés morts. Romanoff et Belova échappent à l’assaut du Taskmaster et partent retrouver Mason qui leur fournit un hélicoptère.
Romanoff et Belova décident de libérer Shostakov de sa prison en Russie dans l’espoir d’apprendre où se situe Dreykov. Après une libération musclée, Shostakov leur révèle qu’il ne sait pas où il se trouve et leur explique qu’elles doivent discuter avec Vostokoff, qui habite dans une ferme où elle travaille le contrôle mental sur des cochons. Les retrouvailles sont tendus : Belova leur révèle qu’elle les avait toujours considérés comme sa famille, mais que cela est visiblement à sens unique, bien que Shostakov et Vostokoff admettent qu’ils avaient toujours voulu qu’ils soient une vraie famille. Tandis que Shostakov réconforte Belova, Vostokoff révèle secrètement la localisation de tout le monde. Elle assomme tout le monde tandis que les agents débarquent pour amener à la Chambre Rouge, qui est désormais une base volante.
Alors que Dreykov félicite Vostokoff pour avoir ramené Romanoff et Belova, il est révélé que Vostokoff et Romanoff avait utilisé une technologie de nano masques pour interchanger leur place dans leur plan, préparant leur propre capture. Face à Dreykov, Black Widow découvre alors que le Taskmaster est Antonia, le fille de Dreykov, qui souffert de lourds dégâts au visage suite à l'explosion qui était sensé tuer Dreykov il y a une dizaine d'années. Dreykov explique qu'il a dû implanter une puce dans son crâne pour l'aider, ainsi que pour faire d'elle le soldat parfait. En cherchant à l'attaquer, Black Widow découvre qu'elle ne peut s'en prendre à Dreykov en raison d'un verrou phéromonal installé dans chaque Veuve. Elle constate également que Dreykov contrôle toutes les Veuves à travers le monde entier depuis l'écran de contrôle de son bureau. Après s'être faite frappée par Dreykov, Romanoff parvint à rompre dans son canal nasal pour annuler l'effet des phéromones et lui permettre d'attaquer Dreykov.
Tandis que Vostokoff tentait de détruire les turbines de la base volante, le Red Guardian affronte le Taskmaster et Belova part à la recherche des Veuves envoyées pour protéger Dreykov. Confronté à sa déroute face à Black Widow, Dreykov prend la fuite tandis que les Veuves s'attaquent collectivement à Romanoff. Belova intervient à temps pour secourir une Black Widow en difficulté en faisant exploser de la poudre rouge pour les libérer du contrôle mental. Black Widow prend alors le contrôle du bureau de Dreykov et copie toutes les localisations des différentes Veuves Noires à travers le monde sur un disque portable, alors que toute la Chambre Rouge autour d'elle explose et s'effondre. Avant de quitter la pièce, Romanoff récupère deux fioles de poudre rouge qui ont survécues à la bombe de Belova. De leur côté, Vostokoff et Shostakov sont contraints de prendra la fuite à travers un appareil volant. De son côté, Belova détruit l'appareil de Dreykov en plein vol, ce qui le tue.
Alors qu'elles étaient en chute libre, au milieu des décombres de la station, Romanoff rattrape Belova et lui donne un parachute avant d'aller s'attaquer une dernière fois au Taskmaster, avant d'atterir au sol. Après un bref combat, Romanoff utilise une fiole de la poudre rouge sur Antonia, la libérant du contrôle mental. Les restes des Veuves libérées arrivent alors sur place, tandis que Belova, Vostokoff et Shostakov font leurs adieux à Romanoff. Belova lui donna sa veste en guise de souvenir, et celle-ci lui donne en retour la dernière fiole de poudre rouge, ainsi que le disque portable, avec pour mission de retrouver et libérer toutes les autres Veuves. Alors qu'ils repartent, aux côtés d'Antonia également, Romanoff attend patiemment l'arrivée de Thaddeus Ross et ses hommes. Deux semaines plus tard, Romanoff, désormais pourvue de cheveux blonds, retrouve Mason, qui lui donne un Quinjet flambant neuf. Romanoff s'en sert pour aller libérer les Avengers retenus au Raft.
Dans une scène post-générique se déroulant après la mort de Romanoff en 2023, Belova rencontre la Contessa Valentina Allegra de Fontaine, qui est son employeuse, sur la tombe de Romanoff. Belova reçoit sa prochaine mission : tuer Clint Barton, l'homme qu'elle affirme être responsable de la mort de Romanoff.